Jak se mění mikrobiologický rozbor a s ním celý obor mikrobiologie vody

Úvod

Ještě dnes řada odborníků považuje mikrobiologický rozbor vody pouze za stanovení koliformních (nově s Escherichia coli) a kultivovatelných mikroorganismů (počtů kolonií). Ale nemusí tomu tak být. Vývoj znalostí o mikrobiálních společenstvech ve vodě je úzce spjat s rozvojem instrumentálních metod v posledních desetiletích. Zhruba do 80. let minulého století byly opravdu mikrobiální procesy studovány převážně na základě stanovení kultivovatelných mikroorganismů, doplněné o mikroskopické pozorování fytoplanktonu a zooplanktonu a základní chemické analýzy. Dnes nové metody umožňují na základě genetických analýz studovat bakteriální společenstvo v celé šíři a je již možné charakterizovat či částečně identifikovat i mikroorganismy (zejména bakterie) nekultivovatelné. Na druhé straně kultivace bakterií má a bude mít pořád (nebo ještě hodně dlouho) hlavní místo.

Úloha mikrobiologie v pitné vodě

Mikrobiologické analýzy slouží (nebo by měly sloužit) k určení resp. hodnocení různých aspektů:

• Zdravotní nezávadnosti vyrobené pitné vody: zjišťuje se na základě indikátorového systému, tzn., nestanovují se patogenní bakterie přímo, ale ověřuje se pomocí indikátorů, zda není voda nekontaminovaná (např. indikátory fekálního nečištění – klíčové indikátory jsou Escherichia coli a intestinální enterokoky). Vlastní patogenní bakterie se stanovují pouze v odůvodněných případech (havarijní, resp. epidemiologická situace).
• Kvalita vody – nestačí jen, aby byla voda zdravotně nezávadná, ale musí být taky dobrá. Některé kultivovatelné mikroorganismy (např. mikromycety, aktinomycety apod.) sice nejsou přímo zdravotně škodlivé, mohou se však podílet na tvorbě nežádoucích látek, které zhoršují organoleptické vlastnosti vody. Při sledování kvality vody nelze též zapomínat na možnosti sekundárního pomnožení mikroorganismů (včetně podmíněně patogenních legionel a mykobakterií) na trase ke spotřebiteli a ve vnitřním vodovodu.
• Kontrola procesů úpravy – aby byla voda „dobrá“, tj. kvalitní a zdravotně nezávadná, je třeba kontrolovat jednotlivé procesy její úpravy. Zde nejde ani tak o přítomnost, resp. nepřítomnost nějaké skupiny bakterií, ale především o jejich změny. Je též třeba hlídat, ale byla voda co nejméně „úživná“, tj. aby obsahovala co nejméně využitelného uhlíku, sloužícího k sekundárnímu pomnožení přítomné mikroflóry. Další neméně důležitou kontrolou úpravy vody je eliminační schopnost používané technologie (zde se též používají indikátory jako E. coli pro eliminaci střevních patogenních bakterií, somatické kolifágy pro eliminaci enterických virů a Clostridium perfringens pro eliminaci parazitických prvoků).

Celkové mikrobiální oživení (pitné) vody

V pitné vodě se nachází vysoký počet tzv. autochtonních bakterií, které nerostou na žádných kultivačních médiích používaných ke stanovení kultivovatelných mikroorganismů (tj. počtů kolonií při 22 a 36 °C). Tyto bakterie jsou detekovatelné pouze přímo, nezávisle na kultivaci (např. mikroskopicky, pomocí metody průtokové cytometrie apod.) a nemají ani taxonomické zařazení. Jsou však živé, a kromě toho jsou i fyziologicky aktivní a podílejí se na různých procesech probíhajících ve vodních systémech. Jedná se tak víceméně o přirozené vodní společenstvo. Naprostá většina bakterií není přítomná ve volné vodě (tj. v planktonní formě), ale v přisedlé složce, v tzv. biofilmech. Stanovení kultivovatelných mikroorganismů (počtů kolonií) v pitných vodách se provádí především proto, že se předpokládá, že mikroorganismy, které rostou na živných půdách, a mají tudíž vyšší afinitu k substrátu (na základě hodnot K, µ_max, V_max) než nekultivovatelné mikroorganismy (v tomto případě především bakterie), mohou mít určitý hygienický význam.

Obecně charakterizovat mikrobiální společenstva surové vody a upravené vody prakticky nelze, protože se pro úpravu vody používají nejrůznější zdroje vod, a to od vody povrchové (např. potok, údolní nádrž) po vodu podzemní. Každý ekosystém má zcela odlišné složení společenstva, které se mění během procesu úpravy vody a její následné distribuce. Například podzemní vody obsahují mnohem méně živin, tudíž mikrobiální společenstva jsou výrazně oligotrofní; v případě kontaminace však bývají mnohem méně schopné samočištění. Zde je nutné zdůraznit, že také v distribučním systému není nejvýznamnější (početně i druhově) mikrobiální společenstvo volné a volně rozptýlené (v planktonu), ale velice významná část společenstva se vyskytuje ve složce přisedlé, tj. v biofilmech v potrubí a na stěnách technologií.

Celkové počty bakterií v upravené (pitné) vodě se mohou lišit. V upravené vodě (těsně po hygienickém zabezpečení) byly ve čtyřech různých úpravnách vod mikroskopicky po barvení DAPI zjištěny průměrné počty bakterií 384 000 až 576 000 v 1 ml; počty kultivovatelných mikroorganismů (počty kolonií při 22 °C) se pohybovaly od 0,006 do 0,001 % [1]. Další autoři zjistili v odtočené pitné vodě celkové počty bakterií (stanovené fluorescenční mikroskopií s barvením LIVE/DEAD Baclight Bacteria Viability Kit) v řádu 10⁴/ml [2] nebo 10⁵/ml [3]. Významně vyšší počet bakterií jak kultivovatelných, tak nekultivovatelných (10⁶/ml) a zejména jejich poměr, se vyskytoval v pitné vodě stagnující v kohoutku (tzv. první podíl, odebíraný bez odtáčení). Podíl kultivovatelných bakterií se v tomto prostředí, vhodném pro jejich existenci, zvýšil až na 1,2 % [2]. Podobné výsledky zjistila i naše pracovní skupina [4]. Další možností, jak sledovat celkové (mikrobiální?) oživení vzorku vody, je stanovení adenosin trifosfátu (ATP) [5]. Test se provádí na základě detekce adenosintrifosfátu (ATP), které představuje molekulu hlavního energetického oběživa v živých buňkách a kolem nich a poskytuje tak přímou míru biologické koncentrace ve vzorku. Detekuje měřením světla pomocí tzv. luminometru. Doplňkové, spíše provozní stanovení je stanovení asimilovatelného organického uhlíku (AOC), které nám ukazuje úživnost vody a s tím spojenou možnost sekundárního pomnožení přítomných mikroorganismů (jak kultivovatelných, tak i nekultivovatelných) v závislosti na jejich afinitě k substrátu [1].

Jak vyplývá z předchozích odstavců, možností jak studovat mikrobiální společenstva (kultivovatelné / nekultivovatelné bakterie, ATP, AOC) je celá řada. Ale nejlepší možný obraz situace se objeví v kombinaci jejich výsledků. Jednotlivě totiž mají tyto výsledky pouze omezenou vypovídací hodnotu.

Možnosti taxonomického zařazení mikroorganismů ve vodním prostředí (do jaké míry lze postihnout celý mikrobiom?)

Mezi mikroorganismy zahrnujeme zástupce prokaryot (sem patří domény Bacteria a Archaea) i eukaryot (drobné mikroskopické houby, tzv. mikromycety, prvoci) a dále organismy tzv. nebuněčné, což jsou viry. Mezi mikroorganismy svým charakterem patří i mikroskopické řasy (eukaryota, rostliny, Plantae) a sinice (prokaryota, fotosyntetizující gramnegativní zástupci domény Bacteria, známé jako cyanobakterie anebo cyanoprokaryota), které se dnes řeší samostatně v rámci studia fytoplanktonu. I když jsou v předchozí kapitole poměrně podrobně popsány možnosti kompletního studia mikrobiálních společenstev ve vodním prostředí, stejně nás v jednu chvíli začne zajímat, jaké taxony jsou přítomny, nebo ještě lépe – co to pro nás znamená. A tady začínají (převážně metodická) omezení.

Nejen v odborné literatuře je skloňován termín mikrobiom, což je dle WIKIPEDIE organizované společenství mikroorganismů kolonizující jakýkoliv prostor (ze starověké řečtiny μικρός = mikrós neboli „malý“ a βίος = biós neboli „život“). Termín je s oblibou používán třeba ve zdravotnictví (znáte určitě např. termín zdravý střevní mikrobiom apod.). Dnes je technicky možné (a nijak složité) izolovat celkovou DNA z prostředí (např. z vody) a zjistit „všechny druhy“ nebo známé sekvence (geny) tam přítomné. Ale u vody (a asi i jinde) to má jeden hlavní problém. Pojmenovat/zařadit můžeme pouze druhy, které existují, jsou popsané a jsou známy jejich sekvence. Někdo je tedy musel vykultivovat a osekvenovat (netvrdím, že všechny rostou například na tryptózovém agaru s kvasničným extraktem, to určitě ne). Tudíž i když v pitné vodě určíme až tisíce přítomných druhů, pořád se pohybujeme v neznámo jak velké (která je určitě mnohem širší než naše „počty kolonií“), ale přeci jen kultivovatelné složce. To je významný rozdíl oproti studiu vícebuněčných organismů.

Pokud chceme alespoň trochu porozumět struktuře mikrobiomu jako takovému, je nutné detekovat širší taxonomické skupiny (například na úrovni domén Archaea/Bacteria, nebo řádů (největší jsou α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria (sem patří i např. čeleď Enterobacteriaceae), ale čím se půjde taxonomicky níže, tím dříve se narazí na metodická omezení (mez detekce). Tyto širší taxonomické skupiny lze detekovat fluorescenčně značenými genovými sondami (FISH), a to buď mikroskopicky, nebo metodou průtokové cytometrie.

Metody molekulární biologie založené na pomnožení nukleových kyselin (např. polymerázová řetězová reakce – PCR) mohou výt využity při stanovení konkrétních (známých) bakterií, např. patogenů (a to včetně virů). I tyto metody mají svá omezení (o tom zase někdy jindy), ale v řadě případů (stanovení virů, nebo obtížně kultivovatelných mikroorganismů) je jejich použití vhodné. Pokud již máme vykultivované kolonie, lze je (s určitou přesností danou konkrétním taxonem) jednoduše identifikovat např. hmotnostní spektrometrií (MALDI-TOF).

Využití znalostí z oboru mikrobiologie ve vodárenské praxi

V tuto chvíli každého čtenáře (nebo alespoň většinu) napadne otázka: k čemu to celé je? Jak to bývá i v jiných oborech, výzkum trochu předběhl aplikaci do praxe, která je více závislá na „soukromém“ financování. V následující bodech se pokusím nastínit příklady alespoň několika možností, jak lze moderní mikrobiologické metody využít k praktickým účelům.

• Změny celkových počtů bakterií (ideálně v automatickém módu) mohou ukazovat např. na výkyvy v systému zásobování pitnou vodou – kolísání stability zdroje surové vody, účinnosti použitých technologií, sledování vlivu teploty nebo stagnace na rozvoj bakterií apod.
• Změny poměru kultivovatelných a nekultivovatelných bakterií – zvýšení přísunu organických látek, resp. zvýšení hygienického rizika.
• Stanovení ATP (lze i terénní) je jednoduché a relativně levné, a poskytuje orientační odhad mikrobiálního oživení (využití při likvidaci havárií, kontrole účinnosti sanace apod.).
• Polymerázová řetězová reakce – využití při identifikaci patogenních mikroorganismů.
• Identifikace bakterií metodou MALDI-TOF – pohled na strukturu „širších skupin“ jako např. koliformní bakterie, intestinální enterokoky a možnost lépe vyhodnotit původ znečištění (fekální apod.), rychlá identifikace bakterií, které lze sice samostatně stanovit, ale protože se to často nedělá, nejsou vždy dostupná selektivní média (např. podmíněný patogen Burkholderia cepacia).
• Kombinace metod – pomoc při hledání zdrojů znečištění.

Závěry

Obor mikrobiologie vody, přestože jako takový prakticky neexistuje, může nabídnout různé možnosti, související s velkým rozvojem instrumentálních metod v posledních 30 letech. Probíhající výzkumy (včetně výzkumů zahraničních) však probíhají poměrně živelně, především v závislosti na modernosti tématu a přísunu finančních prostředků. Finanční stránka je také hlavním omezujícím faktorem (společně s nedostatkem dostatečně vzdělaných a zkušených odborných pracovníků, kteří by byli schopni podrobnější analýzy plánovat a především vyhodnocovat) v této oblasti. Cenný je přístup v nové legislativě [6], kdy se již nepředepisuje „základní mikrobiologický rozbor“ jako takový, ale zvažuje se mnohem více aspektů, jako jsou klíčové vers. indikátorové ukazatele, provozní monitoring, analýza rizik vnitřního vodovodu apod.

Poděkování

Vznik této publikace byl podpořen v rámci MZ ČR – RVO (Státní zdravotní ústav – SZÚ, IČ 75010330).

Seznam literatury

1. Baudišová D., Váňa M., Boháčková Z., Jedličková Z., Benáková A.: Asimilovatelný organický uhlík v systémech výroby a distribuce pitné vody. VTEI 56: 2/2014: 8–11, 2014.
2. Bédard E., Laferrière C., Déziel E., Prévost M.: Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buidlings. PLOS ONE. (https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199429), 2018.
3. Berney M., Vital M., Hűlshoff I., Weilenmann H. U., Egli T., Hammes F.: Rapid, cultivation independent assessment of microbial viability in drinking water. Water Research 42:4010-4018, 2008.
4. Baudišová D., Sovová K., Bobková Š., Šašek J.: Využití metody průtokové cytometrie v mikrobiologii vody. SOVAK 11/2021, str. 17–20. 2021.
5. Baudišová D., Význam a limity využití ukazatele ATP v mikrobiologii vody. Vodní hospodářství, v tisku. 2024.
6. Směrnice Evropského parlamentu a RADY (EU) 2020/2184 ze dne 16. prosince 2020 o jakosti vody určené k lidské spotřebě (přepracované znění).

Článek byl původně zveřejněn ve sborníku konference Pitná voda 2024, dále pak upraven, krácen a připomínkován pro redakci TZB-info